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本试剂盒采用夹心法酶联免疫吸附法，用于定量检测血清、血浆、细胞裂解液、细胞培养上清或尿液等样本中人APOA1的蛋白含量。

预先包被的抗体和检测相抗体都是多克隆抗体。检测相抗体经生物素标记。样品和生物素标记抗体先后加入酶标板孔反应后，PBS或TBS洗涤。随后加入过氧化物酶标记的亲和素反应；经过PBS或TBS的彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人APOA1呈正相关。

ApoAI为单链多肽，由243个氨基酸残基组成，在肝及肠黏膜中合成，主要存在于高密度脂蛋白(HDL)中。HDL主要参与胆固醇从外周组织到肝脏的逆向转运过程。ApoAI是卵磷脂胆固醇酰基转移酶的活化剂。

检测指标：Apo AI;ApoA I;APOA1;apolipoprotein A I;Apolipoprotein A1
检测范围：3.12ng/mL～200ng/mL
灵敏度：500pg/mL
特异性：系统和其它细胞因子无交叉反应

组分	规格
预包被抗人APOA1抗体的96孔板	1块
重组人APOA1冻干标准品	200ng×2
生物素标记抗人APOA1(100×)	100μL
亲和素-过氧化物酶复合物(100×ABC)	100μL
样品稀释液	30mL
抗体稀释液	12mL
ABC稀释液	12mL
TMB显色液	10mL
终止液	10mL
25×洗涤缓冲液	20mL
封板膜	4张

保存：未开启试剂盒可在2～8℃放置，有效期6个月。长期不用请置于-20℃可保存1年。已开启试剂盒请尽快使用，可在2～8℃存放一个月。

• 标准规格酶标仪。
  
• 自动洗板机。
  
• 恒温箱。
  
• 系列可调节移液器及吸头，一次检测样品较多时，最好用多通道移液器。
  
• 干净的试管和Eppendof管。

• 使用前TMB显色液应为无色透明溶液，若发现颜色异常，请及时与我司联系。
  
• 用户在初次使用试剂盒时，应将各种试剂管离心数分钟，以便试剂集中到管底。
  
• 要严格避免操作过程中酶标板干燥。干燥会使酶标板上生物成份迅速失活。
  
• 为免交叉污染，要避免重复使用手中的吸头和试管。
  
• 禁止混用不同批次试剂盒内的试剂。
  
• 本公司提供的96孔酶标板是单条可拆型酶标板，用户可按需求使用；剩余的酶标板请按保存条件贮存。
  
• 揭封板膜和覆盖封板膜时应避免用力过大导致液体溅出。

• 样品如果不立即分析，应分装后冷冻保存，且避免反复冻融。

• 培养上清：离心去除沉淀，立即分析或分装后-20℃冷冻保存。
  
• 尿液样本：用无菌管收集，离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。如有沉淀形成，应再次离心。
  
• 血清样本：用干净试管收集血液，室温凝固30分钟，离心2000×g 20分钟，收集血清。立即分析或分装后-20℃冷冻保存。
  
• 血浆样本：用干净试管收集，EDTA或肝素抗凝血液，30分钟内离心，2000×g 20分钟，收集血浆。立即分析或分装后-20℃冷冻保存。
  
• 贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入适量裂解液，用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。通常10秒后，细胞就会被裂解。
  
• 悬浮细胞：离心收集细胞，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入适量裂解液，用枪吹打把细胞吹散，用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后，10000～14000g离心3～5分钟，取上清。立即分析或分装后-20℃冷冻保存。

用户须估计样品待测因子的含量，决定适当的稀释倍数，以使稀释后样品中待测因子的浓度处于ELISA试剂盒的最佳检测范围。根据待测因子含量高、中、低的不同，分别采取不同的稀释方案，以下方案仅供参考，样品的稀释应有详细记录。

• 高含量：指待测因子在2～20μg/mL。按1∶100稀释。297μL样品稀释液加3μL样品
• 中含量：指待测因子在200ng/mL～2μg/mL。按1∶10稀释。225μL样品稀释液加25μL样品。
  
• 低含量：指待测因子在3120pg/mL～200ng/mL。1∶2稀释。100μL样品稀释液加100μL样品。
  
• 特别低：指待测因子≤3120pg/mL。样品一般不做稀释，或按1∶2稀释。

• 人APOA1标准品的稀释和使用：
  
  • 在使用前2小时内准备。
    
  • 试剂盒提供2管标准品，每管200ng，每次使用1管。
  • 配制200ng/mL标准品：取1mL样品稀释液加入标准品管内，盖好后静置10分钟以上，然后反复颠倒/搓动助溶。
    
  • 配制100ng/mL～3.12ng/mL标准品：准备6只Eppendorf管，每管加0.3mL样品稀释液，分别标记上100、50、25、12.5、6.25、3.12ng/mL。取0.3mL 200ng/mL的标准品加入标记100ng/mL的管中，混匀后同样取出0.3mL，加入下一只管中。余同此类推，直到最后一只样品管。
    • 已经稀释的标准品(200ng/mL)，应在12小时内使用。-20℃条件下，2天内可以使用，不能反复冻融。
• 生物素标记抗人APOA1抗体工作液
  
  • 根据每孔需要100μL计算总的用量(实际配制时应多配制100～200μL)。
    
  • 按1μL生物素标记抗人APOA1(100×)加抗体稀释液99μL的比例配制工作液。轻轻混匀。
• 亲和素-过氧化物酶复合物(ABC)工作液：
  • 在使用前1小时内准备。
  • 根据每孔需要100μL计算总的用量(实配时应多配制100～200μL)。
    
  • 按1μL亲和素-过氧化物酶复合物(100×ABC)加ABC稀释液99μL的比例配制工作液。轻轻混匀。
• 1×洗涤缓冲液：用去离子水将25×洗涤缓冲液稀释25倍，即为1×洗涤缓冲液。

• 手工洗板方法：吸去(不可触及板壁)或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将1×洗涤缓冲液至少0.3mL注入孔内，浸泡1～2分钟。根据需要，重复此过程数次。
  
• 自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。

已稀释好的ABC和TMB显色液在加入酶标板孔前都应预先在37℃中平衡至少30分钟。试剂或样品稀释时，切不可忘记混匀。每次检测都应该做标准曲线。用户须估计样品待测因子的含量，决定适当的稀释倍数。

• 确定本次检测所需的已包被抗体的酶标板孔数目，并增加1孔作为TMB空白显色孔。总数＝样品数+9；做双份检测时×2。其余重包装好放如冰箱中。
  
• 将200、100、50、25、12.5、6.25、3.12ng/mL的标准品各100μL依次加入一排7孔中，1孔只加样品稀释液的作为零孔。对于血清、血浆、细胞裂解液、尿液或细胞培养上清，每孔加100μL已用样品稀释液稀释的样品。
  
• 酶标板加上封板膜，37℃反应90分钟。
  
• 反应后用自动洗板机吸去酶标板内的液体；或甩去酶标板内液体，再对着吸水纸拍几下。不洗。
  
• 将准备好的生物素抗人APOA1抗体工作液按每孔100μL依次加入(TMB空白显色孔除外)。
  
• 酶标板加上封板膜，37℃反应60分钟。
  
• 1×洗涤缓冲液洗涤3次，每次浸泡1分钟左右(每孔洗液至少300μL)。
  
• 将准备好的ABC工作液按每孔100μL依次加入(TMB空白显色孔除外)。
  
• 酶标板加上封板膜，37℃反应30分钟。
  
• 1×洗涤缓冲液洗涤5次，每次浸泡1～2分钟左右(每孔洗液至少300μL)。
  
• 按每孔90μL依次加入TMB显色液，37℃避光反应15～20分钟。
  
  • 显色时间供参考，因用户实验室条件差异，最佳显色时间会有所不同。此时肉眼可见标准品的前3～4孔有明显的梯度蓝色，后3～4孔差别不明显。
• 按每孔100μL依次加入终止液，此时蓝色立转黄色。
  
• 用酶标仪在450nm测定OD值，有两种设定空白对照的方案：
  
  • 将TMB空白显色孔(只加TMB显色液和终止液)设为对照。所有的标准品和样品的吸光值减去TMB空白显色孔的吸光值后，在坐标纸上画出曲线，以吸光值作为纵坐标，以浓度作为横坐标。
    
  • 将零孔设为对照。所有的标准品和样品的吸光值减去零孔的吸光值后，得到的数据可以直接在坐标纸上画出曲线。
• 根据样品的吸光值在坐标上找出对应的浓度。用户也可以使用各种应用软件来计算。
  • 应记住由于样品稀释了N倍，其实际浓度应该×N。

• 加样品和标准品，37℃反应90分钟。不洗。
  
• 加生物素标记抗体，37℃反应60分钟。1×洗涤缓冲液洗涤3次。
  
• 加ABC，37℃反应30分钟。1×洗涤缓冲液洗涤5次。
  
• TMB 37℃反应15～20分钟。
  
• 加入终止液，读数。

浓度(ng/mL)	0.0	3.12	6.25	1.25	25	50	100	200
OD值	0.032	0.225	0.417	0.674	1.137	1.555	1.901	2.14

• 数据供参考，不同用户最佳显色时间会有所不同。

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